Plate forme d'enseignement à distance

Chapitre I : Organisation d’un laboratoire de Biologie Moléculaire……………...

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Chapitre II : Extraction- Purification des acides nucléiques…………………............

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Introduction ……………………………………………………………………………………….

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1) Extraction d’ADN génomique ………………………………………………………………...

2

1.1) Origine des échantillons biologiques ………………………………………………….............

2

1.2) Etapes communes d’une extraction d’ADN…………………………………………………...

3

1.3) Extraction de l’ADN génomique à partir du sang total………………………………………..

3

1.3.1)

Purification et lyse des leucocytes……………………………………………………….

3

1.3.2)

Méthodes d’extraction …………………………………………………………………..

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1.3.2.1)

Méthodes utilisant des solvants organiques : Méthode au phénol-chloroforme…………

5

1.3.2.2)

Méthodes utilisant des solvants non organiques : Méthode de salting out………………

5

1.3.2.3

Méthode d’extraction d’ADN sur phase solide : chelex 100…………………….............

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2)

Extraction de l’ARN……………………………………………………………………

7

2.1)

Conservation de l’échantillon biologique avant extraction des ARN…………………...

7

2.2)

Préparation de l’ARN……………………………………………………………............

7

2.2.1)

Méthodes basées sur l’utilisation de guanidine………………………………………….

7

2.2.1)

Extraction et purification des ARN messagers…………………………………………..

8

3)

Contrôle qualitatif des acides nucléiques extraits…………………………….............

8

3.1)

ADN génomique…………………………………………………………………………

8

3.2)

ARN total………………………………………………………………………………...

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Références bibliographiques………………………………………………………………………..

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Chapitre III : SEPARATION DES ACIDES NUCLEIQUES………………………………….

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1)

Principe de séparation des acides nucléiques…………………………………............

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2)

Gel d’agarose……………………………………………………………………………

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2.1)

Propriétés d’un gel d’agarose……………………………………………………............

11

2.2)

Paramètres de migration…………………………………………………………............

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3)

Gel de polyacrylamide………………………………………………………………….

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3.1)

Polymérisation du gel de polyacrylamide………………………………………………..

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4)

Préparation des gels…………………………………………………………….............

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5)

Tampon de charge (Loading buffer)…………………………………………………..

15

6)

Visualisation des acides nucléiques……………………………………………………

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Références bibliographiques…………………………………………………………….

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Chapitre IV : AMPLIFICATION GENIQUE……………………………………………..........

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Introduction…………………………………………………………………………………………

17

1)

Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) classique……………………………...

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1.1)

Principe de la PCR……………………………………………………………….............

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1.2)

Les composants de la PCR et leur influence sur l’amplification………………………...

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1.2.1)

Concentration en ions magnésium……………………………………………………….

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1.2.2)

Nucléotides (dNTP)……………………………………………………………………...

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1.2.3)

Amorces………………………………………………………………………………….

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1.2.4)

ADN polymérase………………………………………………………………………...

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1.2.5)

L’ADN matrice (template)………………………………………………………………

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2)

Les différents types de PCR……………………………………………………………

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2.1)

Reverse transcription-PCR (RT-PCR)……………………………………………...........

23

2.1.1)

Principe de la RT-PCR……………………………………………………………..........

23

2.1.2)

Amorces utilisées au cours de la rétrotranscription……………………………………...

23

2.1.3)

L’enzyme : la transcriptase inverse……………………………………………………...

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2.1.4)

Déroulement de la Réaction RT-PCR……………………………………………………

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2 .1.5)

Applications de la RT-PCR……………………………………………………………...

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2.2)

PCR spécifique d'allèles/PCR-ARMS…………………………………………………...

26

2.2.1)

Principe…………………………………………………………………………………..

26

2.2.2)

Méthodologie…………………………………………………………………………….

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2.3)

Amplification par PCR en temps réel (rt-PCR)………………………………………….

27

2.3.1)

Principe de rt-PCR……………………………………………………………………….

27

2.3.2)

Méthodologie…………………………………………………………………………….

27

2.3.3)

Cinétique de la rt-PCR…………………………………………………………………...

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2.3.4)

Paramètres de la courbe de fluorescence………………………………………………...

28

2.3.5)

Les systèmes de détection en temps réel………………………………………………...

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2.3.6)

Variante de la PCR en temps réel : RT-PCR en temps réel……………………………..

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2.3.7)

Applications de la PCR et temps réel………………………………………………........

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Références bibliographiques………………………………………………………………………..

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Chapitre V : METHODES DE DETECTION DES VARIATIONS DE SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES……………………………………………………………………………...

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Introduction……………………………………………………………………………....

32

1)

Notion de polymorphismes…………………………………………………………......

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1.1)

Types de polymorphismes……………………………………………………………….

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1.1.1)

Polymorphisme bi-allélique………………………………………………………...........

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1.1.2)

Polymorphismes de répétition ou polymorphismes multi-alléliques…………….............

34

1.2)

Conséquences des polymorphismes…………………………………………………......

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1.3)

Intérêt des polymorphismes……………………………………………………………...

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2)

Principales techniques de détection des variations nucléotidiques………………….

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2.1)

Détection des mutations connues………………………………………………………..

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2.1.1)

Méthode de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)……………………...

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2.1.2)

Technique de Southern Blot…………………………………………………………......

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2.2)

Détection des mutations inconnues……………………………………………………...

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2.2.1)

Technique de D.G.G.E (Denaturating Gel Gradient Electrophoresis)………………....

40

2.2.2)

Technique de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)……………………. 

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Références bibliographiques………………………………………………………………………..

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 Chapitre VI : TECHNIQUES DE SEQUENÇAGE DE L’ADN………………………………

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Introduction…………………………………………………………………………………………

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1)

Intérêt général du séquençage…………………………………………………………

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2)

Techniques de séquençage……………………………………………………………..

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2.1)

Méthode de Maxam-Gilbert……………………………………………………………..

45

2.2)

Méthode de Sanger………………………………………………………………………

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2.2.1)

Principe de la technique du séquençage par la méthode de Sanger……………………..

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2.2.2)

Méthode automatisée de Sanger…………………………………………………………

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3)

Electrophorèse capillaire………………………………………………………………

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Références bibliographiques……………………………………………………………………….

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