cancérologie molécul ...

Chapitre I : Organisation d’un laboratoire de Biologie Moléculaire……………...

1

Chapitre II : Extraction- Purification des acides nucléiques…………………............

2

Introduction ……………………………………………………………………………………….

2

1) Extraction d’ADN génomique ………………………………………………………………...

2

1.1) Origine des échantillons biologiques ………………………………………………….............

2

1.2) Etapes communes d’une extraction d’ADN…………………………………………………...

3

1.3) Extraction de l’ADN génomique à partir du sang total………………………………………..

3

1.3.1)

Purification et lyse des leucocytes……………………………………………………….

3

1.3.2)

Méthodes d’extraction …………………………………………………………………..

5

1.3.2.1)

Méthodes utilisant des solvants organiques : Méthode au phénol-chloroforme…………

5

1.3.2.2)

Méthodes utilisant des solvants non organiques : Méthode de salting out………………

5

1.3.2.3

Méthode d’extraction d’ADN sur phase solide : chelex 100…………………….............

6

2)

Extraction de l’ARN……………………………………………………………………

7

2.1)

Conservation de l’échantillon biologique avant extraction des ARN…………………...

7

2.2)

Préparation de l’ARN……………………………………………………………............

7

2.2.1)

Méthodes basées sur l’utilisation de guanidine………………………………………….

7

2.2.1)

Extraction et purification des ARN messagers…………………………………………..

8

3)

Contrôle qualitatif des acides nucléiques extraits…………………………….............

8

3.1)

ADN génomique…………………………………………………………………………

8

3.2)

ARN total………………………………………………………………………………...

9

Références bibliographiques………………………………………………………………………..

9

Chapitre III : SEPARATION DES ACIDES NUCLEIQUES………………………………….

10

1)

Principe de séparation des acides nucléiques…………………………………............

10

2)

Gel d’agarose……………………………………………………………………………

11

2.1)

Propriétés d’un gel d’agarose……………………………………………………............

11

2.2)

Paramètres de migration…………………………………………………………............

12

3)

Gel de polyacrylamide………………………………………………………………….

13

3.1)

Polymérisation du gel de polyacrylamide………………………………………………..

14

4)

Préparation des gels…………………………………………………………….............

15

5)

Tampon de charge (Loading buffer)…………………………………………………..

15

6)

Visualisation des acides nucléiques……………………………………………………

16

Références bibliographiques…………………………………………………………….

16

Chapitre IV : AMPLIFICATION GENIQUE……………………………………………..........

17

Introduction…………………………………………………………………………………………

17

1)

Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) classique……………………………...

17

1.1)

Principe de la PCR……………………………………………………………….............

18

1.2)

Les composants de la PCR et leur influence sur l’amplification………………………...

20

1.2.1)

Concentration en ions magnésium……………………………………………………….

20

1.2.2)

Nucléotides (dNTP)……………………………………………………………………...

20

1.2.3)

Amorces………………………………………………………………………………….

20

1.2.4)

ADN polymérase………………………………………………………………………...

21

1.2.5)

L’ADN matrice (template)………………………………………………………………

22

2)

Les différents types de PCR……………………………………………………………

23

2.1)

Reverse transcription-PCR (RT-PCR)……………………………………………...........

23

2.1.1)

Principe de la RT-PCR……………………………………………………………..........

23

2.1.2)

Amorces utilisées au cours de la rétrotranscription……………………………………...

23

2.1.3)

L’enzyme : la transcriptase inverse……………………………………………………...

24

2.1.4)

Déroulement de la Réaction RT-PCR……………………………………………………

25

2 .1.5)

Applications de la RT-PCR……………………………………………………………...

26

2.2)

PCR spécifique d'allèles/PCR-ARMS…………………………………………………...

26

2.2.1)

Principe…………………………………………………………………………………..

26

2.2.2)

Méthodologie…………………………………………………………………………….

27

2.3)

Amplification par PCR en temps réel (rt-PCR)………………………………………….

27

2.3.1)

Principe de rt-PCR……………………………………………………………………….

27

2.3.2)

Méthodologie…………………………………………………………………………….

27

2.3.3)

Cinétique de la rt-PCR…………………………………………………………………...

28

2.3.4)

Paramètres de la courbe de fluorescence………………………………………………...

28

2.3.5)

Les systèmes de détection en temps réel………………………………………………...

29

2.3.6)

Variante de la PCR en temps réel : RT-PCR en temps réel……………………………..

30

2.3.7)

Applications de la PCR et temps réel………………………………………………........

31

Références bibliographiques………………………………………………………………………..

31

Chapitre V : METHODES DE DETECTION DES VARIATIONS DE SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES……………………………………………………………………………...

32

Introduction……………………………………………………………………………....

32

1)

Notion de polymorphismes…………………………………………………………......

32

1.1)

Types de polymorphismes……………………………………………………………….

34

1.1.1)

Polymorphisme bi-allélique………………………………………………………...........

34

1.1.2)

Polymorphismes de répétition ou polymorphismes multi-alléliques…………….............

34

1.2)

Conséquences des polymorphismes…………………………………………………......

35

1.3)

Intérêt des polymorphismes……………………………………………………………...

35

2)

Principales techniques de détection des variations nucléotidiques………………….

35

2.1)

Détection des mutations connues………………………………………………………..

36

2.1.1)

Méthode de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)……………………...

36

2.1.2)

Technique de Southern Blot…………………………………………………………......

38

2.2)

Détection des mutations inconnues……………………………………………………...

40

2.2.1)

Technique de D.G.G.E (Denaturating Gel Gradient Electrophoresis)………………....

40

2.2.2)

Technique de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)……………………. 

42

Références bibliographiques………………………………………………………………………..

43

 Chapitre VI : TECHNIQUES DE SEQUENÇAGE DE L’ADN………………………………

44

Introduction…………………………………………………………………………………………

44

1)

Intérêt général du séquençage…………………………………………………………

44

2)

Techniques de séquençage……………………………………………………………..

45

2.1)

Méthode de Maxam-Gilbert……………………………………………………………..

45

2.2)

Méthode de Sanger………………………………………………………………………

45

2.2.1)

Principe de la technique du séquençage par la méthode de Sanger……………………..

45

2.2.2)

Méthode automatisée de Sanger…………………………………………………………

46

3)

Electrophorèse capillaire………………………………………………………………

48

Références bibliographiques……………………………………………………………………….

49